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Cell Engineering

Transient Expression
최근 각광받고 있는 Transient Expression System은 기존의 Stable cell line보다 실험 절차가 간단하며 분석 시간이 짧으며, 트랜스포메이션 효율이 높고 안전하다는 장점을 가진다. 때문에 약품 개발 단계에서 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있고 단기간에 많은 약품 후보들의 screening이 가능하다. 하지만 이 시스템은 생산량이 낮다는 중대한 단점을 가지는데, 이를 극복하기 위하여 세포주 내에 특정 유전자를 삽입시키고 이를 과발현 시킴으로써 함께 삽입된 목적 단백질의 생산도 증가시키는 실험이 진행되고 있다. 

Chaperone Engineering
샤페론은 폴리펩티드를 고유한 기능을 하는 3차원 구조로 접히게 하는 작용을 돕는 단백질 복합체이다. 이 복합체는 적절히 folding 되지 않은 폴리펩티드를 붙잡아 중간산물을 안정화시키고 스트레스 환경에 있는 세포 내에 적절히 folding 되지 않은 폴리펩티드 조각들이 축적되지 않도록 하는 등의 quality control 과정을 수행하기도 한다. 
샤페론을 이용한 cell engineering은 목적 단백질의 적절한 folding에 적합한 환경을 제공하며 궁극적으로 재조합 세포 내에서의 목적 단백질 생산량을 증가시키는 데에 그 목적을 둔다. 샤페론과 결합하는 calnexin, calreticulin, GRP78, ERp57, PDI, 그리고 HSP등의 각종 당단백질에 대한 연구 외에도 Tet-off system이라 불리는 tetracycline-inducible system을 이용하여 샤페론의 단백질 생산량, 퀄리티, 그리고 apoptosis나 autophagy같은 세포의 예정사 조절에 대한 연구를 수행하고 있다. 

Anti Apoptosis / Autophagy Engineering

치료용 단백질 생산에 있어서 사용되는 재조합 CHO 세포는 batch culture가 끝나는 배양 후반에 apoptosis를 경험하며 이를 통해 cell death로 가게 된다. 또한, 생산성을 증가시키기 위해 사용되는 sodium butyrate 첨가나 고삼투압 조절에 의해서도 apoptosis는 일어난다. Apoptosis는 세포의 성장을 멈추어서 총 생산량을 줄이는 단점뿐만 아니라 apoptosis를 겪는 세포가 파쇄됨으로써 세포 내 protease나 sialidase와 같은 효소가 배지에 노출되어 단백질의 질을 저하시키는 결과를 초래한다. 이러한 이유들로 인해 현재 apoptosis를 저해하기 위한 세포 개량 및 배양 조건 최적화 연구가 진행되고 있다. 본 연구실에서는 대표적인 항 예정사 단백질인 bcl-2 단백질을 세포내에 도입하여 apoptosis에 저항성을 지닌 세포주로 개량하는데 성공하였고 또한 apotosis가 일어나는데 매개 역할을 하는 단백질인 caspase 단백질의 발현을 저하시켜서 apoptosis에 저항성을 지닌 세포주 개량에 성공하였다. 앞으로도 apoptosis와 관련된 단백질을 세포내에 도입하여 세포예정사에 안정성을 지니는 세포주 개량에 대한 연구를 진행할 예정이다.



Process Development

Fed-Batch, Perfusion Culture
동물 세포에서의 치료용 단백질과 항체의 생산에 있어서 지난 수십 년간 그 수요는 점점 늘어왔다. 그러나 배양 크기만을 늘려서는 한계가 있었고, 공정과정의 혁신이 필요했다. 생산량에 영향을 미치는 것에는 세포의 최대 농도, 생산성, 생산 기간을 들 수 있는데 batch culture에서는 세포가 자라는데 필요한 영양소가 단기간에 소모되어 세포의 최대 농도가 낮고 배양 기간이 짧을 수 밖에 없었다. 영양소 고갈을 극복하기 위해서 fed-batch culture가 개발되었고 현재 생산 방법의 표준으로 자리잡고 있다. 이 배양에서는 영양소를 새 배지에 농축시켜 배양 중간에 첨가함으로써 영양소의 고갈을 막게 되는데 이는 성장기간을 늘려 세포의 최대 농도를 올려주게 된다. 또한 추가의 첨가(feeding)으로 세포를 고농도에서 살아있는 채로 유지시킨 채 오랜 시간 동안 생산물의 생산을 가능하게 해준다.
Fed-batch culture와 함께 산업적으로 이용되는 다른 하나의 배양 방법은 perfusion culture이다. Fed-batch culture는 영양소의 고갈을 막아주지만 세포가 자라면서 생기는 노폐물이 배지 안에 계속 쌓이기 때문에 배양 기간에 한계가 있다. 하지만 perfusion culture는 세포를 bioreactor안에 유지시킨 채 배양액을 밖으로 조금씩 빼낸다. 동시에 신선한 배지를 공급해 줌으로써 결과적으로는 fed-batch culture보다 세포를 더 높은 농도로 유지시켜 더 적은 부피에서도 고농도의 생산물을 지속적으로 얻을 수 있다. 현재 실험실에는 Applikon사의 acoustic filter를 이용한 perfusion device를 보유 중이다. Perfusion culture는 성장기간보다는 생산기간이 더 길어 배양이 오랜 시간 유지됨으로 인해 시간과 배지가 절약된다. Perfusion culture는 부피당 높은 생산성, 경제적인 이점이 있지만 규모 확대가 힘들고 생산 최적화를 위한 조건을 잡는 시간이 오래 걸린다. 또한 fed-batch culture에 비해 같은 부피의 배양액에서의 생산물의 농도는 낮다
Fed-batch culture와 perfusion culture는 각각 장단점이 있기 때문에 무엇이 더 좋다라고 말할 수 없기 때문에 때에 따라 상황에 따라 방법을 선택하는 것이 더 중요하다.

Culture Condition Optimization
동물세포에서 분비되는 재조합단백질의 생산성 및 질은 온도, pH, 배지의 삼투압, pCO2와 같이 환경요인에 의해 영향을 받게 된다. 이러한 환경요인은 배양공정의 일관성 및 생산성을 높이기 위해 중요한 요인으로 작용하므로 외부환경조건을 적절히 조절하여 세포가 잘 자랄 수 있는 최적화 조건을 찾는 것이 필요하다. 여러 환경요인 중에서 온도는 손쉽게 조절할 수 있으며, 세포성장 및 단백질의 생산성에 영향을 줄 수 있다. pH 역시 intracellular pH, 세포대사, 단백질의 glycosylation, 그리고 생산성에 영향을 줄 수 있으며, 배지의 삼투압 또한 중요한 요인으로 작용하여 세포의 크기, 세포 내 아미노산의 transport를 조절 할 수 있다. 
본 실험실에서는 bioreactor에서 온도, pH, 배지의 삼투압, pCO2 등을 조절함으로써 세포의 성장, 재조합단백질의 생산성 및 활성이 최대치를 가지는 조건을 찾고자 한다.

Serum-Free Media Development
치료용 단백질을 생산하는 recombinant Chinese Hamster Ovary cells (rCHO cells) 배양을 위해 무혈청배지를 개발하려는 노력이 계속되고 있다. 혈청이 첨가된 배지에서 배양할 경우 배지의 단가 증가, mycoplasma, virus, prion과 같은 물질에 의한 감염, 생산된 단백질의 정제 과정의 어려움 등의 단점을 가지고 있기 때문이다. 하지만 무혈청배지에서 배양할 경우 일반적으로 세포 성장과 재조합 단백질의 생산량이 감소하는 경향을 보인다. 이러한 무혈청배지의 단점으로 보완하기 위해 배지첨가물을 첨가함으로써 세포 성장과 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 연구가 진행되고 있다.















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